附錄F 潔凈室生物學(xué)評價(jià)方法

F．1 回、排風(fēng)高效過濾風(fēng)口微生物透過率

F．1．1 儀器設(shè)備和材料應(yīng)符合以下要求：
1 儀器設(shè)備：
Φ90玻璃平皿(或塑料平皿)；
空氣微生物采樣器(固體撞擊式采樣器、離心式采樣器、液體沖擊式采樣器等均可使用，常用的為安德遜(Andersen)采樣器，隸屬于固體撞擊式采樣器)；
微生物氣溶膠發(fā)生器(由氣泵、油水分離器、流量計(jì)、高效過濾器、噴霧器、緩沖瓶等組成)；
各種玻璃移液管、吸管、試管、容器瓶等；
計(jì)時器(如秒表)；
恒溫培養(yǎng)箱；
潔凈工作臺；
高壓蒸汽消毒鍋。
2 材料：
胰蛋白酶大豆瓊脂培養(yǎng)基；
生理鹽水；
75％酒精； 
菌種(宜選用毒性小或沒有毒性，且便于區(qū)別大氣雜菌的特定菌種，常用的有枯草芽孢桿菌、黏質(zhì)沙雷氏菌、大腸噬菌體等)；
采樣介質(zhì)可選用硅酮類、石油胨類、醇類、糖類、纖維素類、蛋白類、混合類、組織培養(yǎng)液等；
套筒(測定回、排風(fēng)高效過濾風(fēng)口時需要使用，罩住整個入口，使檢漏范圍包括邊框，長度應(yīng)使通過氣流時間為0．5s～1s，見圖F．1．1)。

F．1．2 透過率應(yīng)按以下方法評價(jià)：
在回、排風(fēng)高效過濾風(fēng)口進(jìn)風(fēng)端加設(shè)套筒，在套筒口部發(fā)生微生物氣溶膠，在過濾器出風(fēng)面用浮游菌法采樣，由回、排風(fēng)高效過濾風(fēng)口前后的微生物氣溶膠濃度可計(jì)算得出微生物透過率。

F．1．3 檢測步驟應(yīng)符合下列要求：
1 制定方案：明確評價(jià)任務(wù)，制定詳細(xì)的評價(jià)方案，包括確定微生物氣溶膠、發(fā)生器所需的菌液濃度、潔凈壓縮空氣流量，確定在回、排風(fēng)高效過濾風(fēng)口出風(fēng)端的微生物采樣周期、采樣次數(shù)等，一般可根據(jù)回、排風(fēng)高效過濾風(fēng)口的塵埃顆粒物過濾效率進(jìn)行計(jì)算。
2 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：根據(jù)預(yù)先制定的評價(jià)方案，準(zhǔn)備所需材料、儀器設(shè)備，制作采樣培養(yǎng)皿，一般而言，采樣細(xì)菌用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，采集真菌用沙氏或真菌選擇培養(yǎng)基，采樣病毒用根據(jù)病毒特性配制的采樣介質(zhì)。
3 發(fā)生微生物氣溶膠：將培育好的高濃度微生物溶液，一般為(108～1010)cfu／mL，利用生理鹽水按10倍稀釋法逐次稀釋至需要的低濃度(步驟1確定的濃度)，然后由移液管、吸管量取一定容積的低濃度微生物溶液至氣溶膠發(fā)生裝置的溶液瓶，由微生物氣溶膠發(fā)生器在回、排風(fēng)高效過濾風(fēng)口的進(jìn)風(fēng)端將微生物溶液霧化發(fā)生微生物氣溶膠。
4 采樣：對于回、排風(fēng)高效過濾風(fēng)口，可在其后的出風(fēng)管道中采樣，離排風(fēng)高效過濾風(fēng)門的距離根據(jù)實(shí)際工程而定，原則上出風(fēng)后有所混合，能近則好，采樣點(diǎn)沿風(fēng)管寬度方向均勻布置3點(diǎn)。采樣周期、采樣次數(shù)按預(yù)先制定的評價(jià)方案執(zhí)行。采樣過程中，不能中斷微生物氣溶膠的發(fā)生，采樣結(jié)束后才能停止發(fā)生微生物氣溶膠，此后噴霧器中必須尚存不少于一半的微生物溶液，且需對剩余菌液活性進(jìn)行涂布法驗(yàn)證，以修正菌液濃度。
5 培養(yǎng)：將采好的平皿立即蓋上蓋，細(xì)菌類在(35～37)℃培養(yǎng)(1～2)d，結(jié)核菌培養(yǎng)3周，真菌在28℃培養(yǎng)3d。上述培養(yǎng)時間可根據(jù)所采樣微生物特性而適當(dāng)調(diào)整，培養(yǎng)的過程中應(yīng)定期觀察培養(yǎng)箱內(nèi)菌落的生長情況，避免培養(yǎng)箱內(nèi)干燥菌落不生長或培養(yǎng)皿內(nèi)菌落過多充分生長匯合等情況的發(fā)生。
6 計(jì)數(shù)：可以目測、電子顯微鏡、菌落計(jì)數(shù)器等對采集到且培養(yǎng)好的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，當(dāng)采到的菌落很多時，在它們未生長匯合前，用顯微鏡及早觀察，將平皿劃成許多相等的部分抽出一部分?jǐn)?shù)菌，然后乘以所劃份數(shù)，即可得出每皿總菌數(shù)。計(jì)數(shù)完畢后，可根據(jù)式(F．1．3—1)計(jì)算濃度：

8 消毒滅菌：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，需對剩余菌液以及所用各種儀器、設(shè)備、平皿等進(jìn)行消毒滅菌、酒精擦洗處理。

F．1．4 在進(jìn)行潔凈室生物學(xué)評價(jià)時應(yīng)符合以下要求：
1 正式試驗(yàn)前，應(yīng)進(jìn)行預(yù)備試驗(yàn)，并對各種儀器進(jìn)行調(diào)試和標(biāo)定。
2 應(yīng)進(jìn)行陽性對照試驗(yàn)。
3 應(yīng)進(jìn)行陰性對照試驗(yàn)。
4 應(yīng)在陽性試驗(yàn)中長菌，陰性試驗(yàn)組不長菌。
5 實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)注意實(shí)驗(yàn)人員的安全防護(hù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后應(yīng)做好各種儀器、設(shè)備、衣物等的消毒滅菌處理。
6 試驗(yàn)結(jié)束后，需對微生物氣溶膠發(fā)生器內(nèi)的剩余菌液活性進(jìn)行涂布法驗(yàn)證，修正式(F．1．3—3)中的菌液濃度。
7 采樣周期應(yīng)設(shè)計(jì)合理，當(dāng)確定采樣周期存在一定困難時，宜增加采樣次數(shù)，每次采樣使用不同的采樣周期。

F．2 對微生物氣溶膠局部泄漏擴(kuò)散的抑制能力評價(jià)

F．2．1 儀器設(shè)備和材料應(yīng)符合下列要求：除不需要套筒，但需要Φ90培養(yǎng)皿分層布置框架(圖F．2．1所示)外，其他設(shè)備和材料與第F．1．1條相同。

F．2．2 漏泄擴(kuò)散抑制能力可按以下方法評價(jià)：在潔凈室內(nèi)的要求地點(diǎn)(可任意選定或選擇有代表性的地點(diǎn))，用微生物氣溶膠發(fā)生器人工發(fā)菌，進(jìn)行潔凈室對微生物氣溶膠局部泄漏擴(kuò)散的兩類抑制能力的評價(jià)：
1 抑制微生物污染擴(kuò)散有效高度及有效區(qū)域的評價(jià)：利用沉降菌法，將Φ90培養(yǎng)皿按不同垂直高度在室內(nèi)分層均勻布置(如分3層0．8m、1．2m、1．5m，每層對角線5點(diǎn)布置)。
2 自凈時間的評價(jià)：利用浮游菌法進(jìn)行評價(jià)，每隔一段時間用空氣微生物采樣器進(jìn)行采樣，采樣地點(diǎn)宜選擇有代表性的固定區(qū)域(如在1．5m左右的呼吸帶區(qū)域)，觀察潔凈室內(nèi)微生物污染濃度隨時間的變化規(guī)律，從而對潔凈室抑制微生物氣溶膠局部泄漏擴(kuò)散的能力作出評價(jià)。

F．2．3 泄漏擴(kuò)散抑制能力可按以下步驟評價(jià)：
1 制定方案：明確評價(jià)任務(wù)，制定詳細(xì)的評價(jià)方案，包括確定微生物氣溶膠發(fā)生器所需的菌液濃度、潔凈壓縮空氣流量、氣溶膠發(fā)生時間周期(即確定模擬的微生物氣溶膠泄漏擴(kuò)散是瞬時發(fā)生還是持續(xù)發(fā)生，發(fā)生周期為多長)，確定采樣地點(diǎn)、采樣時間間隔、每次采樣的采樣周期、采樣次數(shù)等。
2 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備應(yīng)符合第F．1．3條的要求。
3 發(fā)生微生物氣溶膠：將培育好的高濃度微生物溶液，利用生理鹽水按10倍稀釋法逐次稀釋至需要的低濃度，然后由吸管量取一定容積的低濃度微生物溶液至氣溶膠發(fā)生裝置的溶液瓶，由微生物氣溶膠發(fā)生器在潔凈室內(nèi)的要求地點(diǎn)將微生物溶液霧化發(fā)生微生物氣溶膠。氣溶膠發(fā)生時間周期按預(yù)先制定的評價(jià)方案執(zhí)行。
4 采樣：在潔凈室內(nèi)的要求地點(diǎn)用空氣微生物采樣器進(jìn)行浮游菌法采樣或用Φ90培養(yǎng)皿進(jìn)行沉降菌法采樣，采樣地點(diǎn)、采樣時間間隔、采樣周期、采樣次數(shù)按預(yù)先制定的評價(jià)方案執(zhí)行。
5 培養(yǎng)應(yīng)符合第F．1．3條的要求。
6 計(jì)數(shù)應(yīng)符合第F．1．3條的要求。
7 對微生物氣溶膠局部泄漏擴(kuò)散的抑制能力評價(jià)：
1)沉降菌法：由步驟6得出的每層高度下的每個采樣點(diǎn)的室內(nèi)微生物氣溶膠濃度可對抑制微生物污染擴(kuò)散有效高度及有效區(qū)域作出評價(jià)；
2)浮游菌法；由步驟6得出的每個采樣時刻的潔凈室內(nèi)微生物氣溶膠濃度可作出一條曲線，直觀地反映出潔凈室內(nèi)微生物氣溶膠濃度隨時間的變化規(guī)律，求出自凈時間。
8 消毒滅菌應(yīng)符合第F．1．3條的要求。

F．2．4 評價(jià)應(yīng)符合第F．1．4條的要求。

F．3 生物安全柜的隔離系數(shù)

F．3．1 儀器設(shè)備和材料除不需要套筒外，應(yīng)符合第F．1．2條的規(guī)定。另按現(xiàn)行行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《生物安全柜》JG 170需1根聲Φ70、長為安全柜凈深加150mm的塑料圓筒。

F．3．2 檢測隔離系數(shù)應(yīng)按現(xiàn)行行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《生物安全柜》JG 170第6．3．4條的方法檢驗(yàn)。

F．3．3 安全柜隔離系數(shù)λ按下式評價(jià)：